La thrombopénie à médiation immune primaire est une maladie rare dont la compréhension de sa pathogénie évolue rapidement et est aujourd'hui connue pour être le résultat d'une combinaison d'une réponse immunitaire à médiation humorale et cellulaire en défaveur des plaquettes et des mégacaryocytes. Elle est à distinguer des thrombopénies à médiation immunes secondaires, à une néoplasie, une infection, un processus inflammatoire ou une réaction médicamenteuse. Le diagnostic de cette maladie peut représenter un défi pour le clinicien car il constitue un diagnostic d'exclusion qui de plus, est chronophage. La détection d'anticorps liés aux plaquettes permettrait de mettre en évidence l'existence d'un processus dysimmunitaire primaire ou secondaire et plusieurs études ont mis au point un protocole permettant de détecter ces anticorps par cytométrie en flux. Le but de ce travail est donc de développer un protocole adapté au Biopôle, laboratoire d'analyses vétérinaires présent sur le site de l'École Nationale Vétérinaire d'Alfort, et de confronter les résultats à ceux d'un test ELISA permettant de mettre en évidence les anticorps dirigés contre les plaquettes dans le plasma des patients. Une analyse de cytométrie en flux directe a donc été effectuée sur 19 chiens sains et 14 chiens atteints de thrombopénie, dont 4 atteints de thrombopénie à médiation immune primaire. Les analyses de cytométrie ont été réalisées après isolement d'un plasma riche en plaquettes (PRP) et marquage par des anticorps anti-IgG canins. Un seuil de positivité égal à 10% de plaquettes fluorescentes par analyse cytométrique, mis en place par l'étude de Shropshire et al. (2018), a été choisi. L'intégralité des échantillons des chiens sains a présenté un résultat inférieur à 6%. Ces échantillons ont donc été qualifiés de négatifs, la moyenne de fluorescence étant de 1,6%. La moyenne de fluorescence des plaquettes des échantillons de chiens atteints de thrombopénies à médiation immune, toute causes confondues, était de 28%, soit fortement supérieure à celle des chiens sains. Trois prélèvements de chiens atteints de thrombopénie non immune ont été analysés et ont présenté une moyenne de fluorescence de 1%. Les faibles effectifs des chiens atteints de thrombopénie n'ont pas permis de réaliser d'analyses statistiques, ni d'observer une corrélation avec le test ELISA, mais les résultats de cytométrie de flux semblent montrer une différence notable de fluorescence chez les chiens atteints de thrombopénies à médiation immune par rapport aux autres causes de thrombopénies et aux chiens sains. Cette étude a donc permis de valider le protocole d'isolement du PRP et de marquage des plaquettes par les anticorps. De plus grands effectifs sont à présent nécessaires pour valider la cytométrie de flux pour la détection d'anticorps liés aux plaquettes.

Url / Doi : https://dumas.ccsd.cnrs.fr/dumas-03978561/file/A-2022-079.pdf

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N° de thèse : 079

Bibliogr. p. : 69-71

Titre anglais : Primary immune-mediated thrombopenia - Development of a clinical applicable flow cytometric assay for the detection of platelet-bound antibodies in dogs

Résumé anglais : Autoimmune thrombocytopenia is a rare disease whose pathogenesis is rapidly evolving and is now known to be the result of a combination of a humoral and cellular immune response against platelets and megakaryocytes. It must be distinguished from immune-mediated thrombocytopenia secondary to neoplasia, infection, inflammatory processes or drug reactions. The diagnosis of this disease can be challenging for the clinician as it is a diagnosis of exclusion and is time consuming. The detection of platelet-bound antibodies would reveal the existence of a primary or secondary dysimmune process and several studies have developed a protocol to detect these antibodies by flow cytometry. The aim of this work is therefore to develop a protocol adapted to the Biopôle, a veterinary analysis laboratory located at the National Veterinary School of Alfort, and to compare the results with those of an ELISA test used to detect antibodies directed against platelets in the plasma of patients. Direct flow cytometry analysis was therefore performed on 19 healthy dogs and 14 dogs with thrombocytopenia, including 4 with primary immune-mediated thrombocytopenia. Cytometric analyses were performed after isolation of platelet-rich plasma (PRP) and labeling with anti-canine IgG antibodies. A threshold of positivity equal to 10% of fluorescent platelets by flow cytometry analysis, set up by the study of Shropshire et al. (2018), was chosen. All the samples from the healthy dogs showed fluorescence levels under 6% and were therefore labeled negative, with an average fluorescence of 1.6%. The average platelet fluorescence of the samples from dogs with immune-mediated thrombocytopenia from all causes was 28%, significantly higher than that of the healthy dogs. Three samples from dogs with nonimmune thrombocytopenia were analyzed and showed an average fluorescence of 1%. The small numbers of dogs with thrombocytopenia did not allow any statistical analysis or correlation with the ELISA, but the flow cytometry results appear to show a significant difference in fluorescence in dogs with immune-mediated thrombocytopenia compared with other causes of thrombocytopenia and healthy dogs. This study therefore, validated the protocol for isolation of PRP and labeling of platelets with antibodies. Larger numbers of samples are now needed to validate flow cytometry for the detection of canine platelet-bound antibodies.

Mots-clés anglais : Flow Cytometrie . Immune-mediated thrombopenia . Elisa . Platelet-bound . Antibodies . Dog

Directeur de Thèse : Le Roux, Delphine

Assesseur / Examinateur : Deshuillers, Pierre

Type de fond : Fonds contemporain

Emprunt/Réservation